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Lactobacillus acidophilus est une espèce homofermentaire microaérophile qui fermente les sucres en acide lactique. Elle se développe facilement à des pH relativement bas (inférieurs à 5,0) et sa température optimale de croissance est d'environ 37 °C. Lactobacillus acidophilus est naturellement présente dans le tube digestif, la bouche et les voies urinaires des humains et des animaux. On la retrouve également dans divers aliments fermentés, où elle est utilisée.

Lactobacillus acidophilus possède une capacité exceptionnelle à survivre dans un environnement gastro-acide (pH bas), en présence de sels biliaires et sous la pression de la digestion enzymatique. Cette bactérie lui permet de coloniser les lignées cellulaires épithéliales humaines et le mucus intestinal. Elle présente également les caractéristiques typiques des bactéries lactiques, notamment la production d'acide lactique, d'acide acétique et d'agents antimicrobiens naturels tels que l'acidoline, l'acidophiline et l'aétocidone, qui inhibent la croissance d'autres bactéries. Capable de se développer en présence ou en absence d'oxygène, elle présente une croissance optimale en milieu aérobie et peut même survivre en présence de dioxyde d'azote. Son métabolisme lui permet de digérer les monosaccharides et elle produit de la lactase, une enzyme qui transforme le lactose (sucre du lait) en sucre simple.